Резюме. Фруктозилтрансферазите катализират синтезата на полифруктозани от леванов тип в присъствие на захароза в реакционната среда. В присъствие на акцептори (малтоза, изомалтоза, лактоза, фруктоза) и донор на фруктозни единици – захароза, те синтезират олигозахариди със степен на полимеризация от 3 до 5 монозахаридни остатъка, които притежават пребиотичен потенциал. В настоящото изследване ензимът фруктозилтрансфераза от щам Leuconostoc mesenteroides Lm17 се имобилизира върху многослойна полизахаридна структура, съставена от хитозан и ксантан. Слоевете се нанасяха върху предварително заредени в коронен разряд подложки от полимлечна киселина (ПМК). Получените композитни филми се изследваха за степента на имобилизиране на ензима и възможността за синтез на фруктан върху повърхността на филма. В получените филми се установи активност на ензима от 0,73 U/mg филм. При провеждане на ензимна реакция в присъствие над 10% захароза се установи провеждането на хидролизна и трансфе разна реакция, чрез която се синтезира полизахарид както в разтвора, така и върху мембраната. Повърхностната морфология на многослойните филми се изследва с помощта на атомно силов микроскоп Nanosurf Flex AFM. Получени са стойностите на средноквадратичната грапавост. Установи се, че тя нараства с нарастване на броя на слоевете независимо от последователността им.

Ключови думи: polylactic acid; corona discharge; fructosyltrasnferase; levansucrase; immobilized enzymes

Physics is an ever young science, Varna, October, 27 – 29, 2017

Физиката – вечно млада наука, Варна, 27 – 29 октомври 2017 г.

Увод

Леванзахаразата е фруктозилтрансфераза, която катализира три различни реакции в зависимост от молекулата на фруктозил акцепторната молекула – включително в случая полимеризация, хидролизиране и трансфруктозилиране. Като ключов биокатализатор при синтеза на леван и леванов тип фрукто-олигозахариди, леванзахаразата е широко и интензивно проучвана. Поради обещаващия физиологичен ефект на леван и леванов тип фрукто-олигозахариди те предоставят голям потенциал за приложение в хранително-вкусовата и фармацевтичната промишленост (Sessler et al., 1999; Daudé et al., 2012; Divya & Sugumaran, 2015; Silbir et al., 2014).

Имобилизацията на ензими най-общо може да се определи като включване на ензимната молекула в някаква изолирана фаза, която отделя каталитично активния ензим от фазата на свободния разтвор, но му позволява да контактува с разтворените в него субстрат, инхибитор или ефектор. Тази изолирана фаза, наречена матрица, най-често е неразтворима и представлява високомолекулен, хидрофилен, природен или синтетичен полимер (Nisha et al., 2012; Shintani, 2014).

Целта на настоящата статия е да се изследва хидролазната и трансферазната реакция на имобилизирана фруктозилтрансфераза леванзахараза Lm 17-120 в многослойни филми.

Експеримент

Образуване на подложки от полимлечна киселина

Получаването на филми от полимлечна киселина беше осъществено чрез разтваряне на 2 грама полимлечна киселина (купена от „Лактел“, Америка) в 100 милилитра хлороформ. Разтворът се разбъркваше в продължение на 60 минути върху магнитна бъркалка, след което се изливаше в стъклени петрита и съхнеше до изпаряване на разтворителя. Получените филми бяха изваждани от петритата и бяха изсушавани при 35°C за 48 часа. След това те бяха поставени в ексикатор при стайна температура и относителна влажност 54 % в продължение на 1 денонощие.

Зареждане на подложките в коронен разряд и измерване на техния повърхностен потенциал

От получените филми от полимлечна киселина бяха изрязвани подложки с размери 2,5 х 2,5 cm. Подложките бяха зареждани в коронен разряд с помощта на триелектродна система, състояща се от корониращ електрод във вид на игла, плосък заземен електрод и решетка, поставена между тях. На корониращия електрод беше подавано положително или отрицателно напрежение 5 kV, а на решетката – напрежение 1 kV със същата полярност както на корониращия електрод. Повърхностният потенциал на получените електрети беше измерен по метода на вибриращия електрод с компенсация с грешка, ненадвишаваща 5 %.

Получаване на многослойни филми по метода на потапяне

За получаване на многослойни филми беше използван 1 % разтвор на хитозан и 0,1 % разтвор на ксантан в буферен разтвор с pH 5 и йонна сила 100 mM (ацетатен буфер). Отлагането на слоевете винаги започваше със слой от полиелектролит, който е противоположно зареден на подложката. При положително заредена подложка се отлагаше ксантан като първи слой, а при отрицателно заредена – хитозан. За целта се използваше автоматизираната система Poly Stainer IUL, Spain, като се прилагаше следната последователност на потапяне: 30 минути потапяне в разтвор на ксантан с разтворен в него ензим – леванзахараза Lm17-120; 5 минути промиване в буферен разтвор; 15 минути потапяне в хитозан; 20 минути потапяне в 1,5 % разтвор на натриев триполифосфат в дестилирана вода; 20 минути потапяне в 0,1 % разтвор на глутаров алдехид в дестилирана вода; 5 минути промиване в буферен разтвор. Тази последователност се повтаряше до достигане на желания брой слоеве.

Атомно силова микроскопия

Повърхностната морфология на получените многослойни филми беше анализирана с помощта на атомно силов микроскоп AFM Nanosurf Flex AFM. Повърхностните изображения бяха получени със стандартна игла Tap190Al-G с радиус на острието 10 nm. Времето на сканиране беше 1 секунда. На основата на получените изображения беше пресметната средноквадратичната грапавост.

Определяне на рН-стойностите

Стойностите на рН се измерваха с рН-метър W.T.W Sen. Tix 97T. Всички експерименти за измерване на рН стойностите бяха проведени минимум с трикратна повтаряемост.

Количествено определяне на белтък

Количеството на белтък беше определяно по метода на Брадфорд (Bradford, 1976).

Определяне на ензимната активност на леванзахараза

Ензимната активност беше определена по метода на Dols и съавтори (Dols et al., 1998). Ензимната реакция беше проведена при условия: в 20 mM Na-ацетатен буфер, pH 5.3, съдържащ 100 g/l захароза (Merck чистота 99 %), 0.05 g/l CaCl 2, 1 g/l натриев азид и подходящо разредена с буфер ФТФ при 30°С.

Една единица фруктозилтрансфераза се дефинира като количеството ензим, което катализира получаването на 1 μmol глюкоза за 1 минута при съответните условия за протичане на ензимната реакция. Съдържанието на глюкоза беше определено по метода на Miller с използване на 3,5 – динитросалицилова киселина (ДНСК) (Miller, 1959).

Всички експерименти за определяне на ензимната активност са проведени минимум с трикратна повторяемост.

Oпределяне на трансферазна и хидролазна активност на пречистена леванзахараза

Определяне на съотношението между трансферазната и хидролазната активност на леванзахаразата се извършва при следните реакционни условия: 20 mM натриево ацетатен буфер с рН 5,3; 0,05 g/l CaCl2 и 1 g/l натриев азид при 35°С. Количеството на освободената глюкоза и фруктоза беше определено с ензимен тест K – FRUGL 11/05 (Megazyme) съгласно инструкциите на производителя.

Всички експерименти за определяне на трансферазната и хидролазната активности са проведени минимум с трикратна повтаоряемост. Резултатите бяха обработени със софтуер SigmaPlot 12.0 (Systat Software. Inc).

Резултати и обсъждане

Измерване на повърхностната морфология с атомно силов микроскоп

Беше изследвана повърхностната морфология на многослойни филми с различен брой слоеве (6 и 12 слоя), получени върху положително и отрицателно заредени подложки от ПМК с атомно силов микроскоп. На фиг.1 са представени изображения за многослойни филми, получени върху положително заредени подложки от ПМК, а на фиг. 2 – за многослойни филми, получени върху отрицателно заредени.

В таблица 1 са представени стойностите на средноквадратичната грапавост за многослойни филми от ПМК.

Получените резултати, представени на фиг. 1 и фиг. 2 и в таблица 1, по-казват, че: (а) многослойните филми, получени върху отрицателно заредена подложка от ПМК имат по-висока средноквадратична грапавост в сравнение с тези, получени върху положително заредена подложка; (б) с увеличаване на броя на отложените слоеве се увеличава средноквадратичната грапавост независимо от полярността на подложката, което потвърждава захващането на по-голямо количество полиелектролити.

Фигура 2. Изображения от атомно силова микроскопия за многослойни филми, получени върху отрицателно заредени подложки от ПМК

Изследване на хидролазната и трансферазната активност на имобилизираната леванзахараза

В следващия етап на изследването бяха проучени ефектът на броя слоеве и видът заряд върху имобилизирането на леванзахараза Lm 17-120. Най-висока активност на ензима се детектира при положително зареден филм с 12 слоя (фиг. 3). При изчисляване ефективността на имобилизиране беше установено, че над 35 % от изходния ензим в разтвора се е имобилизирал.

На фиг. 4 са представени данни за стабилността на имобилизирания ензим в продължение на 48 часа. Беше установено, че независимо от количеството имобилизиран ензим в многослойните филми неговата активност да хидролизира захароза, се запазва до 60 минути от началото на процеса. При продължаване на ензимната реакция хидролизата на субстрата рязко спада и е едва 10 % от отчетения максимум на 48 час. Това вероятно се дължи на продуктоинхибиране на ензима или намаляване на хидролазната активност за сметка на трансферазната.

В следващия експеримент се проследи профилът на ензимната активност на леванзахараза Lm 17-120 в присъствие на захароза от 5 до 20 % (фиг. 5). Беше установено, че при концентрация на захароза до 10 % преобладава хидролазната реакция, докато при концентрация над 10 % е налице и трансферазна активност. В резултат на трансферазната активност се синтезират фруктоолигозахариди, като преобладават три и тетразахаридите. Общото количество на синтезираните олигозахариди е сравнително ниско (8 %), което предполага бъдещо оптимизиране на процеса за неговото изместване в посока синтез на по-голямо количество олигозахариди.

Заключение

В резултат на проведените експерименти беше установена възможността за имобилизиране на леванзахараза Lm 17-120 в многослойни филми, като най-ефективен е процесът при положително зареден филм с 12 слоя. Доказана е за първи път трансферазна реакция на имобилизирания ензим в многослоен филм, водеща до синтез на фруктоолигозахариди. Получените резултати са една добра основа за разработване на многослойни филми с имобилизирани ензими, които биха могли да се използват като активни опаковки на хранителни продукти, които по време на съхранението си да повишават своята функционалност, като се синтезират пребиотични олигозахариди.

REFERENCES/ЛИТЕРАТУРА

Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. , 72, 248 – 254.

Daudé, D., Remaud-Siméon, M. & André, I. (2012). Sucrose analogs: an attractive (bio)source for glycodiversification. Nat Prod Rep, 29, 945 – 960.

Divya, J.M. & Sugumaran, K.R. (2015). Fermentation parameters and condition affecting levan production and its applications. J. Chem. & Pharm. Res., 7, 861 – 865.

Dols, M., Remaud-Siméon, M. & Monsan, P. (1998). Optimization of the production of dextransucrase from leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 and its application to the synthesis of non digestible glucooligosaccharides. Proc. 2nd European Symp. Biochem. Sci. , pp. 86 – 92.

Miller, G.L. (1959). Use oi dinitrosalicylic acid reagent for determination on reducing sugar. Anal. Chem., 31, 426 – 428.

Nisha, S., Arun Karthick, S. & Gobi, N. (2012). A review on methods, application and properties of immobilized enzyme. Chem. Sci. Rev. & Lett. , 1(3), 148 – 155.

Sessler, G.H., Sessler, G.M. & Gerhard-Multhaupt, R. (1999). Electrets. Morgan Hill: Laplacian Press.

Shintani, H. (2014). Immobilized enzyme column combined with HPLC and column switching method for the analysis of complicated matrix such as body fluids. Pharm. Reg. Affairs, 3(5), art. no. 1000e142.

Silbir, S., Dagbagli, S., Yegin, S., Baysal, T. & Goksungur, Y. (2014). Levan production by Zymomonasmobilis in batch and continuous fermentation systems. Carbohydrate Polym. , 99, 454 – 461.